本文源于：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第49卷第21期年11月
灵芝Ganodermalucidum(Curtis)P.Karst.为多孔菌科灵芝属药食两用真菌，也是我国具较高药用价值的传统珍贵药材。灵芝自古有“仙草”美誉，在《神农本草经》中列为上品，又称“不死药”，同时也是《本草纲目》中收录的唯一进入五经的药物，对心、肝、脾、肺、肾等五脏具有补益作用。灵芝在世界各地均有分布，并己经实现人工培育，其孢子粉、子实体均可入药。
灵芝孢子粉从成熟灵芝的菌褶中弹射出来，是灵芝的生殖细胞，亦是灵芝的种子，具有灵芝的全部遗传信息，自然条件下极难收集。其呈卵形双壁结构，最外层是能够阻碍人体消化吸收的坚硬的几丁质纤维素，正常情况下需要进行破壁处理。近年来，随着孢子收集和破壁技术的发展，灵芝孢子这一活性部位开始得到人们的重视。
灵芝抱子粉多糖(Ganodermalucidumsporepolysaccharide，GLSP)主要是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖，破壁与不破壁的多糖组成完全相同，是灵芝中的主要活性成分，现己证实其具有广泛的生物活性。己经有多种以GLSP为主要原料的保健食品批准上市。本文通过查阅、整理国内外的研宄报道，对GLSP的结构、提取工艺和生物活性等研宄进展进行综述，为其深入研究提供科学依据。
1GLSP的结构
多糖共有四级结构:一级结构包含单糖的种类、排序、糖苷键构型、链长、分支情况等；二级结构是氢键决定的主链构象；三、四级结构是受非共价键影响的与多糖生物活性关联紧密的空间内有序构象。GLSP种类繁多，结构复杂，多数研宄结果仅对多糖的一级结构加以描述。目前己发现7种GLSP的结构：①SGL-IL-2，相对分子质量为5.37X,主链以1—3、1—6糖苷键链接，平均每10个己糖有3-0及4-02个分支点，以Glc为分支末端残基，侧链中含有1—4Gal［2］。②SGL-III，相对分子质量为1.41X,由葡萄糖和半乳糖组成，物质的量比为4.46:1，其主链由Glc（1—3）和Gal（1—6）构成，分支点分别在6-0、2-0及4-0处［3］。③碱提粗多糖LB-NB，p-D-（1—3）葡聚糖，每4.4个糖残基的6位接有单一的端基葡萄糖，呈单螺旋构象［4］。④GLP1，水溶性多糖经酶法与Sevage法联合脱蛋白，经SepharoseCL-6B柱色谱截取纯化得到的主要成分，并有少量GLP2、GLP5，经分析其为以p型糖苷键为主的多分支结构，平均每10个己糖残基有3个分支［5］。⑤GLP2，Glc和Gal构成的p型少分支结构，以（1—3）Glc和（1—6）Glc为主，平均每10个己糖残基在4-0、3-0处分支。⑥GLP3，Glc和Gal构成的p型少分支结构，主要糖苷键为在6-0处分支的（1—3）Glc和在2-0、4-0分支的（1—6）Gal为主，平均每10个己糖残基有2处分支。⑦Lzps-1，利用色谱柱DEAE-cellulose以及SephadexG-50分离得到总多糖Lzps，主要成分为平均相对分子质量8⑻0的葡聚糖Lzps-1［6］。
2GLSP的提取工艺2.1水提醇沉法
水提醇沉法是GLSP的常见提取方法，将原料按照一定条件（料液比、浸提温度、浸提时间、原料细度等）提取后，收集提取液，再用乙醇沉淀获得多糖。胡斌杰等［7］通过回归分析确定料液比1:20,温度90°C，提取时间2h，80目为最佳提取条件，灵芝多糖提取率为1.51°%。
2.2超声提取法
超声波利用热学效应、空化效应等破坏细胞外壁，通过粉碎、搅拌加快多糖溶解，具有高效、快速、不破坏结构等特点。
张梅［8］通过单因素实验利用二元回归方程得到各提取因素对GLSP提取率的影响大小顺序：料液比＜提取时间＜温度，得到最佳提取条件：料液比1:30,4诎以超声处理，温度40°C，提取时间2h，
提取率为2.19%。
2.3微波提取法
微波会使以水为主的极性分子吸收大量能量，导致细胞内部液态水汽化，使细胞的膜结构被破坏，出现孔洞，促进了细胞内外的物质交换，加速溶解释放胞内产物。微波提取法中各因素对灵芝多糖提取效率的影响程度顺序：微波时间＞微波功率＞浸润时间［9］。李国香等［10］结合高效凝胶过滤色谱（HPGFC）手段，得到破壁GLSP的最佳提取条件为料液比1:15，温度C，微波功率3⑻W，提取时间15min，提取率大于1%，且以相对分子质量大于1X的多糖为主。
2.4酶提取法
酶能够有效破坏细胞的膜结构，促进细胞内部多糖的释放。董玉玮等［11］利用纤维素酶与水提醇沉法结合提取灵芝多糖，得到在以下条件提取效果最好：料液比1:5，酶浓度0.5%，pH值5.0，55C恒温酶解80min，提取率为1.2%。
2.5超声波协同纤维素酶提取法
超声波的空化效应能够破坏纤维素大分子有序排列形成的束状结晶区域、去除酶触纤维妨碍物，提高酶水解效率［12］。采用超声波协同纤维素酶提取法，以料液比1:50,pH5,纤维素酶浓度2%，超声功率W，50C恒温1h的条件提取灵芝多糖，提取率比同条件下水提法提高1.7倍（从7.8g/L提高至11.5g/L）［11］。
2.6超微粉碎技术
灵芝孢子是成熟的灵芝菌褶释放的卵形生殖细胞，其坚硬的外壁阻碍人体利用细胞内的有效成分，应当通过物理、化学、生物、机械等方法破坏外壁，多糖的提取率与外壁的粉碎度呈正相关。利用HSCS超细粉碎机对灵芝孢子粉粉碎60min，转速16⑻r/min，用扫描电镜和红外色谱检测，孢壁完全打碎，有效物质团状溶出且未被破坏，稳定性提高，提取率提高40.8%［13］。黄璞［14］将灵芝孢子粉水浸12h后适用高压均质抽滤，冷冻干燥12h，超微粉碎（r/min、20min），破壁率达95%，GLSP提取率提高30%。
2.7挤压技术
挤压加工技术通过混合、搅拌、破碎、加热、蒸煮、杀菌、膨化等方式，利用机械摩擦作用，对原料产生强大压力，使水分快速汽化，物料膨化，使原料变得疏松多孔、酥脆，利于多糖溶解［15］。焦
艳丽等［16］以料液比1:30，温度80C,30⑻r/min离心10min，得到灵芝孢子破壁率达78.6%，GLSP得率为2.22%。进行二次挤压后，灵芝孢子破壁率提高至83.48%，GLSP得率为2.37%。
2.8低温熔融处理
灵芝孢子外壁的导热速度很慢，冷冻-解冻处理会使得外壁的内表面温度明显异于外表面，温度差形成热应力冲击孢子粉外壁并促使其破裂，提高收率。实验证明，在-76°C冷冻6min后微波处理解冻2min，如此循环5次，并用超声波破碎，GLSP收率提高0.6%［17-18］。
3GLSP的药理活性
研宄证明相对分子质量大于1X的p型GLSP具有生物活性［19］，活性与溶解度、黏度等因素呈正相关［20-21］。
3.1免疫调节作用
细胞免疫是由效应T细胞介导的直接杀死靶细胞的免疫过程。张坤等［22］ig给予荷瘤小鼠不同浓度的GLSP，每天1次，给药10d后取血测得给药组小鼠比空白组廓清指数和吞噬系数明显提高，此外GLSP对CD3、CD4、CD8及杀伤性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞具有増强作用，荷瘤小鼠的细胞免疫能力显著上升［23］。
体液免疫中外来物质作为抗原进入体内刺激T细胞产生淋巴因子，并进一步増殖分化为抗体，产生抗原-抗体反应，实现免疫过程，可以根据产生抗体的量判断免疫剧烈程度。向成年雌性小鼠体内注射绵羊血红细胞，并ip生理盐水和GLSP50mg/kg，连续5d，观察血清内IgG和补体C3质量分数，发现二者分别提高了2.4g/L和0.24g/L［4］，由此说明，GLSP可以促进小鼠淋巴细胞产生抗体，发挥免疫调节作用。
巨噬细胞是组织器官中具有非特异性吞噬作用和免疫调节等作用的一种吞噬细胞，机体免疫活性和巨噬细胞的吞噬能力呈正相关。利用碱提取GLSP，作用于小鼠骨髓巨噬细胞24h，细胞出现体积显著变大、颜色加深等形态学变化。GLSP能够促使细胞分泌白细胞介素-1p（IL-1p）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）和一氧化氮（NO），显著提高巨噬细胞对乳胶颗粒的吞噬能力，且呈剂量依赖性［24］。
自然杀伤（NK）细胞是一种不经过抗原刺激就可以直接识别的靶细胞。王鹏云等［25］将小鼠脾细胞与靶细胞（淋巴瘤YAC-1细胞）、GLSP混合培养20h，以MTT法检验YAC-1细胞杀伤率，发现GLSP组比对照组提高10%以上，具有更为明显的免疫活性。
此外，GLSP能够预防过敏反应、阻碍小鼠的迟发型过敏反应、削弱绵羊红细胞的初次抗体应答［26］，这一特性是其治疗自身免疫疾病和防止过敏反应的基础。
3.2抗肿瘤作用
Zhang等［27］用灵芝孢子葡聚糖（GLIS）作用于小鼠脾源性肉瘤细胞Si80,培养15d后GLIS能激活大量免疫球蛋白，并促使其分泌大量免疫活性物质IL-1p和活性氮中间体，明显提高了巨噬细胞介导的肿瘤细胞毒作用，对肿瘤生长的抑制率达到60%。
GLSP对肺癌有抑制作用并提高NK细胞活性［5］。将GLSP作为唯一的抗癌剂对30名肿瘤患者进行了为期12周的治疗，肿瘤来源包括肺、乳腺、肝、结肠、前列腺、膀胱和脑。结果表明，与对照组比较，实验组受试者体内IL-1、TNF-a含量明显降低，IL-2、IL-6、y干扰素（IFN-y）含量増加，T淋巴细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞含量略有上升，NK细胞活性显著提高，表明GLSP能够抑制癌细胞的増殖与扩散［28］。
3.3抗氧化作用
灵芝孢子粉具有抗氧化能力，且抗氧化活性与GLSP浓度呈正相关［29］。以水杨酸作为Fenton反应产生的羟基自由基的捕捉剂，以维生素C作为羟基自由基的清除剂，在nm下测量吸光度值，测得4g/L的未破壁GLSP的抗氧化率为60%?75%。
You等［30］考察灵芝多糖肽（GLPP）对叔丁基氢过氧化物（tBOOH）损伤的小鼠腹腔巨噬细胞中活性氧（ROS）的影响，用MTT法测定细胞存活率，在电子显微镜下观察细胞形态变化，发现在2⑻mg/LGLPP作用下，细胞存活率为90%，说明GLPP具有良好的ROS抑制作用。
3.4抗神经性疾病作用
GLSP能够阻止小胶质细胞的活化，抑制脂多糖诱导的原代多巴胺能神经元变性［31］。
阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病均与细胞内蛋白异常降解有关。将GLPS作用于蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞模型，用CCK-8检测细胞活性，AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡情况，结果表明，GLSP使细胞凋亡率降低19%，细胞内a-synuclein蛋白表达水平明显降低［32］。
3.5抗衰老作用
P-半乳糖苷酶（p-gal）活性提高是公认的衰老细胞生物学标志［33］。邹美圣等［34］用血管紧张素II（AngII）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）建立衰老模型，用CCK-8法测定细胞存活率，发现
mg/LGLSP会使细胞存活率提高10%，且SAp-gal的活性明显降低。
3.6保肝作用
CCl4导致的肝损伤与自由基产生和脂质过氧化相关，何学斌等［35］对48只肝损伤小鼠分别ig给予生理盐水和灵芝多糖，给药9d后测定小鼠血清丙氨酸氨基移换酶（SGPT）值、肝匀浆过氧化物（LPO）含量、血浆丙二醛（NDA）含量，发现GLP对SGPT升高具有诘抗作用，并减少LPO、MDA含量，具有护肝作用。
乃-氨基半乳糖（GalN）诱发的动物肝损伤与人类急性重度肝炎相似，丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）是评价肝炎的敏感指标。GLSP能使GalN诱导的肝炎小鼠肝脏中ALT、AST含量降低40?60U/L，LPO、MDA含量降低，防止脂质过氧化，维持膜的正常结构，保护肝脏［36］。
3.7其他作用
通过小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核实验发现，环磷酰胺会诱导正常细胞染色体突变，GLSP高剂量组细胞中环磷酰胺含量明显降低，具有对抗染色体突变的效果［37］。灵芝酸性蛋白多糖（APBP）对感染单纯疱瘆病毒-1（HSV-1）、HSV-2的非洲绿猴肾细胞Vero抗病毒的半数最大效应浓度（EC50）值分别为、mg/mL，APBP与a干扰素协同具有更强的抗病毒能力［38］。超氧化物歧化酶（SOD）活性是评价辐照后机体恢复水平的重要指标。用灵芝多糖合剂对经4Gy60Co射线辐照的小鼠连续ig给药40d。采用NBT光化还原法检测发现，给药组小鼠的SOD活性比对照组高13.68%，具有明显的抗辐射能力［39］。GLSP能激发小鼠腹腔酸性磷酸酶及p-葡萄糖醛酸酶活性，阻止免疫性肌炎大鼠肌肉组织中磷酸肌酸激酶（CPK）的下降及血清中CPK的升高，并使肌肉炎症变性减轻，具有抗炎症能力［40］。
4GLSP的应用
由于GLSP具有多种药理活性，己经在药品、食品等领域得到了广泛地应用。GLSP用于肺癌的临床治疗并初获成效［28］。中科院上海有机化学研宄所开发了剂量为20?50mg/kg、剂型为冻干粉针剂
的GLSP注射剂。并利用GLSP抗癌症的功能，将之与鱼腥草、半枝莲、蒲公英等组合，研发得到能清热解毒、促使癌症早期患者康复的保健品［41］。
在食品领域中，己有多家公司生产了以GLSP为标志成分提高免疫力的国产保健食品，如中科灵芝孢子胶囊、芳莲牌灵茶胶囊、金日牌蜂灵胶囊等。并将异麦芽糖醇和GLSP与辅料相结合，研制出能増强免疫的GLSP含片［42］。将GLSP和不同年份的普洱茶膏为主要原料，研制出了具有清除自由基、抗衰老、提高SOD活性、降血糖等功效的保健茶品［43］。
5研究前景展望
目前己有的GLSP提取方法中依旧存在耗时长、工序繁琐等缺点，传统的微波等提取方法使GLSP化学键遭到破坏而结构改变，收率降低。高电压脉冲电场浸提技术（PEF）具有低温高效、速效经济等显著优点，可以降低多糖提取过程中的不利改变，利用高电位特性瞬间杀菌，在功能食品领域具有广泛的应用前景，己被证实能够应用于植物的多糖提取［44］。高速剪切技术是广泛用于植物有效成分提取的一种高效易行节能的均质化技术，己被应用于枸杞、浒苔等多糖的提取分离，能够大幅提高收率［45-46］。因此，未来可将新技术与GLSP的提取相结合，以在高效提取的同时，实现环保节能循环利用。
现有的对多糖的一级结构的分析技术手段主要有化学分析、仪器分析和生物分析3类，化学分析法作为经典方法存在消耗样品多、过程繁琐等缺点，目前正被仪器、生物分析等方法所取代。原子力显微镜（AFM）可以利用原子探针直接观察三维空间内的分子链构型及尺寸，观察与酶结合前后的支链的形态学差异判断分支点。免疫学方法利用抗原-抗体反应比较样品和己知结构糖的抑制常数，判断未知结构的糖链的连接方式。对于GLSP高级结构的研宄目前常用X射线衍射和圆二色谱，上述多种方法均己应用于灵芝多糖的结构鉴定［47-48］。
灵芝孢子粉作为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传信息，GLSP也因而具有比灵芝多糖更为优异的理化性质，应用前景也更为广阔，值得进行更加深入的研宄。实验证明相同提取工艺下GLSP的收率比灵芝子实体多糖和菌丝多糖的收率高1%以上［49-51］，此外，GLSP在养肝护肝、抗辐射、抗基因突变、抗炎症等方面具有重要作用，而此类作用并未在灵芝菌丝体多糖相关研宄中得到证实［52-53］。
现阶段关于灵芝的功能食品多以灵芝多糖作为
标志性成分，己有多种以预防肝损伤、预防辐射，提高免疫力等为目的的保健食品投入市场，以灵芝为原料的具有美白、补水、防冻伤等功能的化妆品也己经问世，GLSP作为灵芝多糖中活性强、收率高的成分，可试用于上述各种产品[54]。
6结语
灵芝孢子中的主要化学成分与灵芝子实体部位相似，包括蛋白质氨基酸类、多糖类和三萜类等。其中多糖和三萜是灵芝及其孢子的主要活性物质，同时这两类物质的含量亦是评价灵芝质量的重要标准。目前常采用醇浸碱提酸沉法提取灵芝孢子粉中的三萜类化合物，接着将醇提后的滤渣采用热水浸提醇析法分离多糖，再将醇回收循环利用，实现材料的充分巧用。
GLSP主要有5种提取工艺，以水提醇沉法最为经典，也是工业生产提取最常用方法。包裹在孢子粉外层的几丁质纤维素严重阻碍了GLSP的提取，粉碎程度的高低决定了多糖的提取率，因此灵芝孢子粉的破壁技术也是影响GLSP提取利用的重要环节之一，目前常用的破壁技术主要有物理法、机械法等，但各破壁技术都有其自身不足，未来应考虑将多种破壁方法结合应用，各取所长、互补短板，以提高破壁率，増加多糖利用效率。
GLSP具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、抗基因突变、保肝等多种生物活性，其中以抗肿瘤、抗氧化、调节免疫为研宄热点，其抗肿瘤作用己经得到了临床应用。未来的研宄应将灵芝的抗肿瘤活性与调节免疫作用相结合，在抗肿瘤的同时提高自身免疫力，使其抗肿瘤功效显著提高，也可辅助用于放化疗后的免疫力恢复。
GLSP作为灵芝的主要功效成分，己经得到了市场的充分认可，己有多种灵芝孢子粉保健食品上市，但对GLSP结构的研宄还不够深入，仅解析了SGL-IL-2、SGL-III、LB-NB、Lzps-1、GLP1等少数几种多糖的初级结构，未来还需要对GLSP展开更为广泛的深入研宄，在保证其安全性的前提下，使其在抗肿瘤、调节免疫力、抗辐射等领域充分发挥作用，为其综合开发利用提供系统、全面的依据。
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