北京白癜风哪家最好 http://m.39.net/news/ylzx/bjzkhbzy/

灵芝多糖的研究进展

谢苗*

摘要灵芝，自古被视为救死扶伤，延年益寿的良药。灵芝含有多种有效成分，其中灵芝多糖是其重要组成成分之一。近年来，灵芝多糖因其具有抗肿瘤，抗氧化等生物活性已经引起了广泛科研工作者的兴趣。随着灵芝人工栽培技术的发展，近些年对灵芝子实体多糖、灵芝孢子粉多糖、灵芝菌丝体多糖等的研究如雨后春笋，基于满足公众了解灵芝多糖的目的，概括与总结了近十年灵芝多糖的研究进展：灵芝多糖提取工艺，如热水浸提法、微波辅助提取、酶法提取；分离纯化包括去色素、去蛋白、乙醇分级等；分子修饰如羧甲基化、硫酸化、乙酰化等；生物活性如清除自由基活性、提高巨噬细胞活性、抗肿瘤等；通过FT-IR测定官能团，HPLC测定单糖组成，NMR测定多糖的结构表征等方面确定多糖结构。

关键词灵芝多糖；生物活性；分离纯化；结构修饰

灵芝，好气性真菌属多孔菌科。灵芝在我国中药学中历史悠久，以林中生长的为最佳，药效最高。目前已有人工大棚种植，主要生长在潮湿的区域。灵芝富含灵芝多糖、三萜类、腺苷、甾醇、生物碱等多种有效成分[1]，其中最重要的有效成分之一便是灵芝多糖。灵芝多糖具有提高机体免疫力、抗衰老、抗肿瘤、助眠等功能。灵芝多糖包括菌丝体多糖、发酵液多糖和子实体多糖及灵芝孢子粉多糖，根据近十年的灵芝多糖研究，综合叙述了灵芝多糖的提取、分离纯化、生物活性、分子修饰及结构解析。

1灵芝多糖的提取

1.1热水浸提法取适量灵芝子实体磨成粉，于适宜浓度的酒精中浸泡以去除脂类及小分子杂质。利用多糖易溶于水而不易溶于乙醇等有机溶剂的特性提取多糖。热水浸提法源于古人煎药，煎药时要求水质、水量、煎的次数与火候，所以提取多糖时也要要求不同温度、不同体积的溶剂、不同的浸提时间及不同的浸提次数，热水提取的多糖含量因条件变化而不同，可以通过响应面和正交的方法，得到提取率最高的优化提取工艺流程，热水浸提法是一种对多糖的破坏性最小的提取方式。根据殷远滔[2]的方法，水提法的最佳工艺条件为：提取温度90℃，提取时间为1.5h，酒精浓度90%，料液比1：40（g/mL，下同），pH7.5，在此条件下多糖提取率0.%。1.2微波辅助提取随着技术的发展，微波辅助已被广泛应用于提取生物物质，微波提取可以加速细胞破碎，使细胞内的物质释放利于多糖等水溶性物质充分溶于水中，因此微波辅助提取变得高效便捷。根据贾少杰[3]的方法结合响应面分析，微波辅助的最佳工艺条件为功率为W，提取时间为23min，料液比1：15，重复浸提2次，在此条件下，灵芝多糖提取率达到了4.62%，与热水浸提法相比，大大提高了提取效率。1.3碱法提取多糖分为酸性多糖、中性多糖和碱性多糖，仅仅用热水提取难以将一些酸性和碱性多糖充分提取出来，所以针对多糖PH的性质不同，选择合适的溶剂来提取相应的多糖。由于酸性试剂会改变多糖的结构，所以通常用碱液来获得多糖。王景[4]等人通过正交的方法得出赤灵芝在碱法提取的最佳工艺：提取温度60℃，料液比1：15，浸提时间2h，碱液浓度为5%，重复浸提3次。在此优化条件下，多糖得率达到10.98%。1.4酶法提取酶作为一种生物催化剂，具有安全、高效的特性。由于传统水提法多糖得率不高，很有可能是受细胞膜、细胞壁的限制，胞内多糖释放不够完全。酶种类多，且具有专一性，能够快速破坏细胞结构，可以使多糖充分溶解。目前多糖的酶法提取有单一酶提和复合酶提法，由于复合酶的作用更广泛，所以复合酶法提取多糖更受欢迎。朱玲[5]等人利用响应面进行优化提取，结论是复合酶的用量为木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纤维素酶1.6%、果胶酶2.3%，在60℃、pH为4.6的条件下，料液比为1：16，反应min，此时，灵芝多糖的提取率为4.41%。

2灵芝多糖纯化

2.1Sevage法脱蛋白利用多糖的水溶性进行提取的同时，一些水溶性蛋白也混合在粗多糖产品中，所以蛋白质的去除是多糖纯化的重要组成部分。利用蛋白质在有机溶剂中变性的原理，将提取的粗多糖溶于蒸馏水中，在多糖溶液中加入氯仿与正丁醇的体积比为4：1的Sevage试剂[6],使蛋白质变性与多糖溶液分离，重复几次，直至无白色物质析出，再根据考马斯亮蓝法检测蛋白质的含量[7]。2.2去色素在灵芝多糖提取过程中，往往存在有大量色素，这些色素很有可能会影响多糖的功能，并且在后续多糖结构测定中产生一定的影响，因此常采用H2O2法除色素。在碱性条件下，H2O2的电离作用增强，对色素具有具有攻击作用[8]。田淑雨等[9]比较了多种灵芝多糖的脱色方法，试验结果表明H2O2在脱色工艺中值得进一步开发利用，H2O2脱色的最优条件为pH8左右，H2O2的体积分数为8%，温度50℃，时间2h，此时灵芝多糖的脱色率为84.11%,多糖保留率73.12%。2.3超滤超滤是一种膜分离技术，根据分子大小不同将物质进行分离，利用一定的截留分子量的中空纤维膜进行超滤，从而获得不同分子量的目标物质。王博等[10]利用超滤膜对灵芝多糖进行了分离，得到了不同分子量段的多糖，还通过响应面确定分离多糖的最佳工艺：料液比为1：7.6，超滤压力为0.43MPa，温度为35℃，膜面流速为15.5m/s；在此条件下多糖得率为1.%，纯度达86.4%。2.4酒精分级粗多糖是一种复合有机物，且活性较强的多糖往往集中在一定分子量范围内，因此，我们应进行活性部位筛选，酒精分级则是利用不同浓度的酒精的极性不同，从而将不同分子量的多糖分离。将获得的粗多糖溶解于少量的蒸馏水中，向多糖浓缩液中加乙醇溶液，使酒精终浓度达到目标浓度，如20%、30%、40%、50%、80%等分别获得相应的多糖。杨德[11]采用乙醇分级获得GLP40(酒精终浓度为40%,下同)、GLP65、GLP80，实验表明，GLP65的含量最多，GLP65和GLP40的含量占总多糖含量的82.98%，虽然GLP80含量低，但其抗氧化活性明显高于其他两个组分。2.5层析层析是生物学中常用的分离纯化方法，根据徐雪峰[12]等的方法，粗多糖GLP用洗脱缓冲液溶解后上离子交换层析柱，依次用Tris-HCI缓冲液及含梯度浓度的NaCl的Tris-HCI缓冲液洗脱，以一定的流速洗脱并收集流出溶液，测定多糖含量；将通过离子层析分离得到的组分过凝胶层析柱进一步分离得到单一多糖[13]。

3分子修饰

3.1乙酰化修饰乙酰化是较普遍的一种结构化修饰，经验证，乙酰化多糖可以增加多糖的水溶性[14]，使生物活性明显增强，因此，对多糖进行乙酰化已成为当前的研究热点，乙酰化就是将乙酰基转移到多糖的侧链上，从而衍生化得到一种新的物质。根据叶颖霞[15]的方法，取适量均一多糖溶于纯水中，用NaOH调节溶液pH值，然后缓慢滴加甲酰胺，反应过程中不断搅拌，反应完成后再慢慢滴加盐酸至溶液呈中性，后用乙醇溶液进行沉淀，沉淀物用95%乙醇洗涤，冷冻干燥后溶解于蒸馏水中在透析袋透析72h，离心，浓缩，醇沉，冷冻干燥即得乙酰化灵芝多糖。3.2硫酸化修饰多糖的硫酸化是指多糖的糖羟基被SO42-取代后，不仅增强了多糖的水溶性，还提高了多糖的生物活性。经相关报道，硫酸化的多糖抗肿瘤活性及提高机体免疫力的能力明显提高[16]。Ling[17]等人，将吡啶置于带有冷凝和搅拌装置的三颈瓶中，在冰浴条件下冷却，然后在半小时内缓慢滴加氯磺酸直至产生淡黄色固体，将多糖在沸水浴中用二甲基甲酰胺溶解，再用NaOH溶液调节pH至中性，将溶液置于透析袋中分别用自来水和蒸馏水进行透析，离心，浓缩，干燥后即为硫酸化多糖。3.3羧甲基修饰多糖的羧甲基化就是指将羧甲基基团转移到多糖大分子物质上，芦昶彤[18]将灵芝多糖先进行碱化处理，再将氯乙酸和异丙醇的混合液缓慢加入碱化的多糖处理液中并不时搅拌，之后把反应体系放于60℃条件下反应一段时间，取反应体系的水相加乙醇沉淀，沉淀物加水复溶，滴加HCL溶液使体系pH至中性，再进行醇沉，离心，透析，干燥等一系列过程，结果表明：羧甲基化灵芝多糖对烟丝保润效果佳，且能降低吸烟时的刺激性，感官效果倍增。3.4其他结构化修饰多糖还可以进行甲基化、磷酸化、烷基化、硬脂酸化等多种修饰，但在灵芝多糖的结构修饰中，这些修饰却鲜见，这可能是目前对灵芝多糖研究的空白点，也可能是难以攻克的一个研究方向，空白点与难点是研究的动力，随着科技的发展，这一空白点将会不断补全。

4生物活性

4.1抗氧化活性多糖具有抗氧化活性[19]，据说是因为多糖具有半缩醛羟基，即还原性末端，使得自由基还原，从而清除自由基，但其明确的抗氧化机制尚未阐明。目前，公信力较大的看法一是多糖上的的氢原子能够与自由基反应生成水，且反应生成单电子可以进一步被还原；二是多糖可以捕获脂质反应中生成的自由基，或者与金属离子螯合，而这些金属离子正是形成自由基必不可少的因子；三是可以加强机体内某些抗氧化酶如超氧化物歧化酶等的活性，从而更好发挥抗氧化能力；四是可以调节机体免疫，以达到抗氧化效果。针对灵芝多糖的抗氧化活性，许多学者对其进行了深入研究，如清除DPPH自由基，清除羟自由基，清除ABTS自由基等，结果表明：灵芝多糖的浓度与抗氧化活性成线性关系[20-22]。4.2增强巨噬细胞活性取浓度为3×个/mL的细胞，将细胞接种到96孔细胞培养板中[23]，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养3.5h，弃上清液，加含有10%FBS的细胞培养液洗涤后，再加入Griess试剂，测吸光值，与标准亚硝酸盐对照计算NO的水平。结果表明，GLP可提高大鼠巨噬细胞吞噬功能和细胞活性，促进巨噬细胞分泌NO。4.3抗肿瘤活性及增强机体免疫力多糖是数以万聚的原子组成的高分子化合物，它可以刺激巨噬细胞激活人体免疫系统。巨噬细胞作为人体第三道防线，对抵御外来病原体具有重大意义。灵芝多糖抗癌机理中较有代表性理论是以下三种机理—免疫功能论、端粒酶论、促分化论[24]。

5.结构解析

5.1UV的应用紫外线(UV)是电磁波谱中波长从-nm辐射的总称，在进行紫外波段全扫描时，nm可以确定多糖的存在，通过检测nm有无吸收峰可以确定所测样品是否含有蛋白质，nm可以检测核酸的存在，利用紫外分光光度计在nm测吸光值，还可以判断色素有无残留。5.2FT-IR的应用傅里叶变换红外光谱仪(FourierTransformInfraredSpectrometer，简称FT-IR)是对干涉后的红外光进行傅里叶变换的原理而开发的红外光谱仪，红外区又分为远红外区、中红外区和近红外区，一般采用中红外区(0-cm-1)的峰的位置以确定多糖的化学键或官能团的种类，可以通过不同波数段产生的峰型、峰位置和峰强度来确定官能团的运动状态，进而确定多糖的类型，比如是呋喃型还是吡喃型。Shuang[25]等人根据FTIR的图谱中在cm-1处的吸收峰，确认该多糖为α-构型。5.3HPAEC-PAD的应用配有脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱(highperformanceanionexchangedchromatography-pulsedamperometricdetector)，HPAEC可用于检测多糖的单糖组成成分，先测定若干种标准单糖的保留时间，再将多糖进行水解，测定其水解产物的保留时间，将结果与标准单糖进行比对，从而确定多糖的单糖组成成分，再根据峰面积确定单糖的分子量及各种单糖的比率。高坤[26]等提出，20E(乙醇浓度达20%)的灵芝发酵胞外多糖主要由葡萄糖构成，还含有少量木糖、甘露糖和半乳糖。5.4NMR的应用核磁共振(NuclearMagneticResonance，简称NMR)，简单而言，就是共振而吸收某一定频率的射频辐射的物理过程，NMR在现代科学技术上应用甚广。在核磁共振技术尚未引入多糖解析领域时，多糖的结构解析较困难，不如核酸、蛋白质的发展前景明朗，随着核磁共振在多糖结构解析的成功应用，使得多糖的发展向前迈出了跨越性的一步。我们可以从一维氢谱提供结构得出化学位移、偶合裂分（耦合常数）、峰面积等的信息。二维核磁共振谱是有两个时间变量，这就使得在一维谱中难以确认的信号变得清晰明了。顾菲菲[27]通过碱提灵芝多糖的核磁图谱，推断出该多糖是由β糖苷键连接的吡喃型葡萄糖构成，综合分析结果表明，此多糖是由β-(1→3)和β-(1→6)连接的葡聚糖。

6小结

灵芝作为一种天然产物，自古因其“起死回生”的功效，被笼罩在神秘的面纱之下，随着灵芝人工栽培技术的实现和普及，灵芝不再是可望而不可即的灵丹妙药，它变换着不同的身份呈现在我们的生活中，如含有灵芝提取物的美妆品、破壁灵芝孢子粉，灵芝胶囊、灵芝片等。科学是不断探索的，随着科技的发展，灵芝中的有效成分也被揭示在公众面前，灵芝多糖作为其重要的组成部分，在提取工艺、纯化流程、活性探究、衍生化及结构解析等方面取得了日新月异的重大进展，这为我们进一步开发和开拓灵芝产品提供了可行性与新思路。参考文献[1]贡济宇,于波,于澎等.酚硫酸法测定灵芝多糖含量的实验研究[J].长春中医学院学报,,(1):45.[2]殷远滔,姚庆智.灵芝多糖提取工艺研究[J].微生物前沿,,7(1):26-37.[3]贾少杰,解修超,邓百万等.微波辅助法提取灵芝多糖工艺的优化及抑菌活性[J].北方园艺,(18):-.[4]王景,蔡雪峰.正交设计法优化赤灵芝中碱溶性纯化多糖的提取工艺[J].中西医结合心血管病电子杂志，,4(3)：-.[5]朱玲,史吉平,王晨光等.响应面法优化灵芝多糖的酶法提取工艺研究[J].食品工业科技,,37(24):-.[6]张丽霞,张雅君,张丽萍.灵芝多糖的提取纯化及其免疫活性[J].西北农林科技大学学报,(6):-.[7]聂昌宏,郑欣,阿依居来克·卡得尔等.考马斯亮蓝法检测不同乳中乳清蛋白含量[J].食品安全质量检测学报，,10(5):-.[8]孙涛涛,蔡为荣,谢亮亮等.江香薷多糖的过氧化氢脱色研究[J].安徽工程大学学报,,31(2),26-31.[9]田淑雨,陈韵,鹿士峰等.灵芝多糖脱色工艺研究[J].食品安全质量检测学报,,10(4):-.[10]王博,斯聪聪,程国才.响应面优化超滤膜分离灵芝多糖工艺[J].食品工业,,36(12):1-4.[11]杨德,周明,程薇等.灵芝多糖提取纯化及抗氧化研究[J].湖北农业科学,,49(11):-.[12]徐雪峰,李桂娟,闫浩等.赤灵芝多糖分离纯化及体外抗氧化性研究[J].食品与机械,,13(1):-.[13]段晓颖,郭娇,马秋莹等.灵芝多糖提取及纯化工艺[J].时珍国医国药,,29(1):58-60.[14]房芳,柳春燕,陈靠山等.多糖乙酰化修饰的最新研究进展[J].黑龙江八一农垦大学学报,,29(2):42-47.[15]叶颖霞,赵菊香,陈盛强等.灵芝多糖乙酰化及其抗氧化活性研究[J].安徽中医药大学学报，，35（2）:75-79.[16]曾茂林,周本宏,郭咸希.硫酸化多糖抗肿瘤研究进展[J].中国药师,,21(6):-.[17]LingChen,GangliangHuang.Antioxidantactivitiesofsulfatedpumpkinpolysacchrides[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,,:-.

[18]芦昶彤,侯佩,孙志涛等.灵芝多糖的羧甲基化修饰及其保润性能研究[J].郑州轻工业学院学报(自然科学版）,,30(5/6):49-53.

[19]许兰仙,马文平.多糖抗氧化研究进展[J].食品工艺,(9):48-49.[20]操丽丽,周俊,郑峰等.高压热水提取灵芝多糖及对其抗氧化活性的影响[J].食品科学技术学报,,36(2):68-62+77.[21]陈杰,董扬,鲁吉珂等.3种不同产地灵芝子实体粗多糖体外抗氧化活性比较研究[J].食品工业科技，，37(21):-.[22]牟建楼,刘亚琼,马艳莉等.灵芝水提物及其抗氧化性研究[J].食品科技,,40(11):-.[23]康峰.灵芝多糖对长期运动大鼠巨噬细胞吞噬功能及NO和IL-1β表达的影响[J].动物医学进展,,38(6):61-65.

[24]蔺丽,方能虎,吴旦.灵芝的主要生物活性研究概况[J].中国食菌,,21(3):38-40.

[25]ShuangSun,kejuanli,longXiao,etal.CharacterizationofpolysacchridefromHelicteresangustifoliaL.anditsimmunomodulatoryactivitiesonmacrophagesRAW.7[J].BiomedicinePharmacotherapy,,:-

[26]高坤,冯杰,颜梦秋等.灵芝液态发酵高产胞外多糖菌株筛选及多糖特性分析[J].菌物学报,,38(6):1-9.

[27]顾菲菲,李佳,杨晨东等.碱提灵芝多糖的分离纯化、结构表征及免疫活性评价[J].中草药,,49(10):-.

TheResearchProgressofGanodermaLucidumPolysaccharide

Abstract:GanodermalucidumhasbeenregardedasusefulChinesemedcineinChinesehistory,whichcouldcurediseaseandkeeppeoplelongevity.Ganodermalucidumincludesmanykindseffectiveingredient,Ganodermalucidumpolysaccharide(GLP)isoneofthemostimportant