白癜风病发病原因 http://m.39.net/pf/a_4302816.html
摘要
01
从灵芝耳蜗中分离到一类具有6/6/5/6/6/6环系统的单萜类化合物A?C（1?3）。化合物1?3是选择性COX-2抑制剂，在nm处的IC50值为（?）-2。定点突变鉴定His为COX-2活性位点。针对小鼠的急性肺损伤进行了（-）-2的体内抗炎活性。
研究背景
02
炎症几乎与所有疾病有关，例如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，慢性肉芽肿（CGD），癌症以及心血管和神经系统疾病。尽管存在多种炎症介质，但环氧化酶（COX）途径中的花生四烯酸级联反应是最重要的。因此，靶向COX是开发非甾体抗炎药（NSAIDs）来治疗炎症相关疾病的绝佳策略。传统的非甾体抗炎药具有很多不良反应，包括胃肠道出血，中风和肾衰竭等，因为它们对三种COX酶亚型（COX-1-3）没有选择性。为了克服非甾体抗炎药（NSAIDs）的缺点，COX选择性抑制剂被开发出来，而开发理想非甾体抗炎药的新策略主要集中在COX-2抑制剂，特别是那些与COX-2和COX-1亚型具有平衡相互作用的抑制剂。
图1：化合物1-3结构
灵芝耳蜗中分离出的三对结构新颖的类萜类对映体，它们具有由6/6/5/6/6/6环系统和两个螺环中心组成的独特骨架。这些化合物被称为双螺旋球菌类固醇（图1），是选择性的COX-2抑制剂，对小鼠的急性肺损伤（ALI）具有活性。此外，它们在对接分析指导的诱变研究中很有用，该研究发现了酶催化口袋的疏水通道中的关键残基，并开发出设计下一代COX-2抑制剂的新策略。
结构解析
03
根据高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）、13C-NMR和DEPT光谱数据的分析，得到了分子式C42H50O7，含有18个不饱和度。13CNMR和DEPT光谱表明存在42个碳，对应于6个甲基、8个亚甲基、13个次甲基（11个烯烃和2个脂肪族，包括1个含氧化合物）和15个非质子化碳（1个羰基，10个烯烃其中4个含氧，3个脂肪族其中2个被氧化）。化合物1的1HNMR谱包含两个ABX自旋系统[6.32(1H,d,J=2.6Hz,H-3)，6.74(1H,dd,J=8.7,2.6Hz,H-5)，6.76(1H,d,J=8.7Hz,H-6)，6.71(1H,d,J=2.5Hz,H-3′)，6.57(1H,dd,J=8.7,2.5Hz,H-5′)，6.58(1H,d,J=8.7Hz,H-6′)]，六甲基单线态和五个烯烃质子。鉴于先前从该属中分离出的其他天然产物的性质，核磁数据表明化合物1可能是单萜类二聚体。通过对2DNMR数据的分析证实了这一结论。化合物1的1H-1H相关光谱（COSY）光谱显示了H-11/H-12/H-13，H-16/H-17/H-18的相关性（图2），其与杂核多键结合通过C-2′?C-7′连接到倍半萜片段上。
图2：化合物1和2的关键COSY，HMBC和ROESY相关系数
HMBC光谱中H-10（5.42）/C-1，H-8，H-10，Hb-11/C-7，H-13/C-7和H-3/C的相关性表明，在化合物1中还存在两个额外的芳环B和D。这些环中的C-C双键与五个附加双键和一个羰基构成了16个不饱和度。因此，剩余的两个不饱和度以化合物1中的两个附加环的形式存在。在DMSO-d6的1H-NMR共振的光谱中观察到4-OH、4′-OH和10′-OH，并分析ROESY光谱数据（图2）确定为游离羟基。C-7（89.1）、C-10和C-14′（80.0）的13CNMR化学位移表明形成了C环和E环，使A部分成为灵芝霉素I的类似物，从而确定了化合物1的平面结构。
主要通过分析ROESY数据确定化合物1的立体构型。H-8/Ha-11/10-OH的ROESY相关性可以确定B环中的立体中心。同样，Hb-12/H3-15的相关性表明这些质子位于同一面上。此外，Hb-12/H3-15和H-6/H3-15（弱）的ROESY相关性（图2）既证实了环E的存在，又表明了立体异构体的相对构型。通过观察H-10’/Hb-12’，H-10’/Ha-11’，H-8’和H3-15’的ROESY相关性可以确定环A和E之间的空间关系，表明环D以椅状构型存在，并且15-CH3是轴向取向的。
数据表明，在1中的立体定位中心的相对构型是7S*,9S*,10S*,13R*,14S*。此外，基于H-13/H-16的ROESY相关性，确定C-13和C-14的C-C双键具有E构型。值得注意的是，化合物1是以外消旋混合物形式分离出来的。使用手性相高效液相色谱分离得到两种对映体，并用实验和ECD光谱法（SI）测定了（?）-1中立体中心的绝对构型。计算出的（7S，9S，10S，13R，14S）-1a的ECD谱图与（-）-1的实验谱图非常吻合，表明（-）-1是7S，9S，10S，13R，14S对映异构体。
对（±）-dispirocochlearoidB（2）的数据表明其分子式与化合物1相同。对1D和2DNMR数据的详细分析表明，化合物2与1具有相同的平面结构，但在B环立体化学中存在差异。化合物2中H-8/H-8′和H-8/10′-OH的ROESY关联（图2），而不是化合物1中的H-8/H-11′/10′-OH关联，表明化合物2的C-9′和C-2的相对构型不同于化合物1。这一结论由10′-OH照射后H-8的NOE增强所证实。此外，H3-15′/H2-12′的ROESY关联证实了C-13在E环的相对构型与化合物1相同。幸运的是，通过H-10/H-13的关键关联，可以将化合物2中的立体定位中心的相对构型确定为7S*，9R*，10S*，13R*，14S*。基于H-12/H-15和H-13/H-16的ROESY相关性，确定化合物2的侧链中的C-C双键的立体构型为E。使用手性相HPLC分离的2个外消旋体分离得到两个对映体，其中的（+）-2经过实验和ECD。结果表明，（7R，9S，10R，13S，14R）-2的ECD谱图几乎与（+）-2的实验谱图重叠。
化合物3在结构上与2相似，唯一的区别在于侧链。值得注意的是，化合物1-3都是外消旋体。为了检验这些分离物是天然产物还是人造物，对新鲜制备的耳蜗的甲醇和丙酮提取物进行了LC-HRESIMS分析。结果表明，1?3可能是通过非酶催化自然生成的化合物。
结果与讨论
04
灵芝真菌被称为“万能药”，广泛用于治疗相关炎症疾病。我们的先前的研究表明，该属中的酚类物质相当多。这类化合物是否与灵芝属植物的抗炎作用有关引起了我们的 结果表明，这些天然产物均表现出对COX-2有抑制活性，其中以（?）-2最为活跃。进一步的研究表明（-）-2对COX-2（IC50=nM）比对COX-1（IC50=29.μM）的抑制作用更明显（图3C）。利用人类COX-2蛋白模型5IKQ进行研究，探索（-）-2与COX-2的结合模式。在COX-2结合囊附近发现了一系列可能重要的结合残基，包括N，Q，H，Y和S，进一步分析的结果表明，（-）-2与疏水通道中的残基之间存在H键，从而得到蛋白质的催化位点。具体来说，在模型中，（-）-2的10-OH与His形成H键，C-11和C-12通过H键与Tyr相互作用。这些相互作用可以帮助将该抑制剂定位在疏水性COX-2通道中（图3D）。进行丙氨酸扫描测定以确定直接参与（-）-2与COX-2结合的残基。为此，进行了COX-2重组蛋白的定点诱变，其中用丙氨酸取代了预期对控制COX-2结合起重要作用的残基。结果表明，His和Tyr突变体显着提高了结合（-）-2的IC50值（图3B）。这与分子对接分析的结果一致，这些发现表明两个突变（His，Tyr）均显着削弱了（-）-2对COX-2的抑制作用。
据报道，几种已知的抑制剂，包括氟比洛芬，吲哚美辛，和萘普生与Tyr在COX-2中相互作用，这是催化环氧合酶反应的关键残基。与Tyr不同，His先前未被确定为抑制COX-2的重要结合残基。因此，观察到His是COX-2催化腔疏水通道中的一个关键残基，这一发现表明了一种新的策略，可用于设计下一代COX-2抑制剂。
图4：化合物（?）-2减轻了ALI模型小鼠的肺损伤
小鼠经尾静脉注射DMSO或（?）-2（5mg/kg）预处理30min后，气管内滴注LPS5mg/kg。6小时后，对老鼠进行安乐死和解剖。
（A，B）肺组织中COX-2表达的蛋白质印迹分析。
（C）IL-1β、（D）IL-6表达的定量聚合酶链反应（Q-PCR）分析。
（E）化合物（-）-2减弱了LPS诱导的肺组织组织病理学变化（H＆E染色）。
结果以平均值±标准差（n=5）表示。
*P0.05；**P0.01；ns，不显著。
由于COX-2是开发治疗炎症药物的重要靶点，因此我们评估了产自耳蜗的meroterpenoid的体外和体内抗炎特性。使用MTT测定法来评估经meroterpenoid处理的细胞在小鼠腹膜巨噬细胞中的活力。结果显示，六种天然产物不显示出显著的细胞毒性。天然产物对脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞的抗炎活性研究的结果表明，所有六种化合物均抑制LPS诱导的促炎细胞因子IL-6和IL-1β的mRNA表达和蛋白质的产生。此外，还发现（-）-2以剂量依赖性方式抑制COX-2，PGE2和促炎细胞因子（包括IL-6和IL-1β）的表达。除此之外，还使用免疫印迹法分析LPS刺激的巨噬细胞中的NF-κB和MAPK信号通路。结果表明（-）-2显着抑制NF-κB信号通路的激活，包括降低IKKα/β，IκBα和p65的磷酸化，但对MAPK信号通路没有影响。最后，（-）-2显着抑制LPS诱导的ALI小鼠的炎症，这与抑制晶状体上皮细胞（LEC），嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润，支气管肺泡灌洗液（BALF）从而使蛋白质浓度降低，以及抑制PGE2和促炎性细胞因子有关。此外，（-）-2抑制了肺组织中COX-2的表达并减少了ALI小鼠的肺损伤（图4）。这些数据证明（-）-2及其类似物在体外和体内均具有抑制COX-2和抗炎的功效。
原文信息
05
本文于年3月13日在线发表于杂志OrganicLetters，第一作者是Fu-YingQin，Hao-XingZhang，Qian-QianDi，通讯作者为Wei-LinChen，Yong-XianCheng，通讯单位为深圳生命科学与海洋学院医学部大学。
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