灵芝产品质量管控体系的构建

陈若芸康洁杜国华李保明刘超王洪庆

（中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京）

灵芝是保健品中应用最广泛的一种药用真菌，是近四十年来研究的热点之一。全球灵芝研究论文总数已超过1万篇，相关的专利也有近项，取得国家认证的灵芝保健品有多种，含有灵芝的药品和复方有近多种。灵芝产品在我国的销售额累计已超过亿人民币。随着国家把“保健食品”列入支撑“大健康产业”的政策公布，在接下来的十几年，甚至几十年里，保健食品作为“治未病”、提升群众健康水平的朝阳产业一定会有大的发展。随着群众本身健康意识的提高、经济收入的增加，以及老龄化带来的特殊因素，以上各项数字还会继续攀升。

尽管灵芝研究的论文专利众多，但关于质量控制方面的研究还比较缺乏。我们在研究的过程中发现以下诸多问题需要解决。

接上文

02灵芝栽培质量的管控问题

各地灵芝培养基质有很大的不同，有段木、棉籽壳、玉米芯、薏苡仁壳、巨菌草、象草等，不同培养基质对灵芝质量有什么影响？灵芝栽培方式有大棚种植、陆地种植、仿野生、工厂化栽培和发酵培养等，不同栽培模式对灵芝质量有什么影响？不同种植地区如西北、东北、华北、华南等，不同气候、土壤对质量有什么影响？以及不同采收时间对质量的影响等，这些都缺乏系统的研究。

03灵芝子实体的质量标准问题

年美国第38版药典[2]添加了灵芝子实体质量标准。对比中美两个药典标准，感到我国药典的标准不够完善。版中华人民共和国药典对灵芝子实体质量的要求：水溶性浸出物不得少于3.0%；含灵芝多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于0.90%；含三萜及甾醇以齐墩果酸（C30H48O3）计，不得少于0.50%。美国药典对灵芝子实体质量的要求还有薄层色谱和HPLC等。薄层色谱要求，标准溶液A：灵芝酸A标准品，标准溶液B：麦角甾醇标准品，标准溶液C：灵芝子实体粉状提取物标准品。超声10min，离心，取上清。样品溶液：1g粉碎的灵芝子实体于50mL醇中超声15min，离心，取上清，在50℃以下减压蒸发至干。把残留溶于2.0毫升醇中，离心，取上清。吸附物：平均粒度5μm的高效薄层硅胶板，先将薄层硅胶板在甲醇中预展开，再于℃干燥30分钟。使用体积：标准溶液A和B各2μL及标准溶液C和样品溶液各4μL，8mm大的斑点。温度：室温，不超过30℃。展开剂：甲苯，甲酸乙酯和甲酸（5︰5︰0.2），显色剂：10％的硫酸。薄层类型：在长波紫外光（nm）和白光下，薄层显示斑点类型与表3中所表明的颜色和位置对应。保留因子的重复性：标准溶液A、B得到的保留因子误差在表3中标定值±10％以内。

美国药典对灵芝水溶性多糖测试包括5种标准品：甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和L-岩藻糖。检测溶液的HPLC色谱峰的保留时间，单个的衍生单糖有如下的相对保留时间（min）：甘露糖0.48，来苏糖0.58，D-葡萄糖醛酸0.82，半乳糖1.09和L-岩藻糖1.35。对应于标准溶液的色谱中应该有这些糖的相应峰，该标准的优点在于防止加入淀粉冒充多糖。美国药典计算所有确认的甘露糖，D-葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖和L-岩藻糖百分比的总和不少于干重的0.7％。美国药典（HPLC法）：灵芝子实体对三萜的检测包括10种三萜，以灵芝酸A、B、C2、D、F、G、H，灵芝烯酸B、C、D计算，三萜酸含量不少于0.3％。中国药典用比色法测定灵芝总三萜及甾醇，按干燥品计算，含三萜及甾醇以齐墩果酸（C30H48O3）不得少于0.50%。灵芝中没有存在齐墩果酸的报道，所以以齐墩果酸作为对照品不科学。美国药典灵芝子实体三萜的检测方法值得我们借鉴。李保明等[3]以9个灵芝三萜酸为标准品，测定了不同地区和不同栽培方式的31个灵芝样品的三萜酸含量，基本都在0.3％左右。

04灵芝孢子粉的质量标准问题

灵芝孢子粉作为药品已有40年的应用历史，最早是年由中国医学科学院药物研究所研制，北京协和药厂生产的准字号药品“增肌注射液”，用于治疗肌肉萎缩、肌强直和硬皮病。4年改为“灵孢多糖注射液”，以核苷作为质量控制标准。尽管近30年来灵芝孢子粉及破壁灵芝孢子粉作为保健品广泛使用，但孢子粉的化学成分及质量标准一直研究不多。

从赤芝孢子粉中得到的甾醇类化合物有：ergosta-7,22-dien-3,5a,6-triol；rgosta-7,22-dien-3,5,6-triol；ergosta-7,9,22-trien-3,5,6-triol；ergosterolpalmitate；ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one和ergosterol等，含量一般在万分之一到十万分之一。从赤芝孢子粉中得到的三萜类化合物有：赤芝孢子内酯A（ganosporelactoneA），赤芝孢子内酯B（ganosporelactoneB），赤芝孢子酸A（ganosporericacidA），灵芝酸B（ganodericacidB），灵芝酸C（ganodericacidC），灵芝酸E（ganodericacidE）和灵芝三醇（ganodermanontriol）。这些三萜的含量都很低，一般在十万分之一到百万分之一。以什么成分作为测定对照品或标准品灵芝孢子粉含量，需要进行系统研究。

对灵芝孢子粉质量的影响也有很多方面，首先孢子粉收集时间：有的地方收集20～30天，有的地方收集90天，是否收集20天的就比90天的质量好？收集90天最早喷出的孢子粉和最后喷出的孢子粉在质量上、活性上是否有差异？目前没有研究报道。其次孢子粉的收集方式：各地收集方式各不相同，有套筒收集，有铺塑料膜收集，有抽风机收集，也有吸尘机式收集，不同收集方式对质量和活性是否有影响也没有研究报道。灵芝孢子粉质量标准，多为省属地方标准或生产厂家的企业标准，多为微观、生物学、卫生和重金属方面的检测，缺乏HPLC方法对化学成分的检测。

05灵芝孢子油的质量标准问题目前灵芝孢子油在市场上占有很大的销售份额，但缺乏统一的质量测定标准。文献报道用气相色谱与质谱（GC—MS）联用分析，从超临界CO2萃取孢子油中鉴定出18种脂肪酸成分，包括6种不饱和脂肪酸、7种饱和脂肪酸、2种环链脂肪酸，以及己酸、辛酸、壬酸等短链脂肪酸。GC定量分析结果表明：灵芝孢子油中含9种已知脂肪酸，不饱和脂肪酸总量为73.6%，其中，主体成分油酸、亚油酸和棕榈酸含量分别为57.5%、13.4%和19.6%，不饱和脂肪酸十六碳烯酸、亚麻酸的含量为2.2%、0.5%。从灵芝孢子油中分离得到的甾醇类化合物有：ergosta-7,22-dien-3,5,6-triol；ergosta-7,22-dien-3,5,6-triol；异岩藻甾醇；ergosta-8(14)-22-dien-3,7-diol；ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one；-谷甾醇；（22E,24R）ergosta-7,22-dien-3-ol和ergosta-7,22-dien-3-ol等。

福建中医药大学余素[4]以灵芝酸C1为对照品对9个灵芝孢子油样品进行三萜酸含量检测，结果有2个未检出三萜酸。检出灵芝三萜酸C1的7个样品，其含量在百万分之五到十万分之七，只是检测到相同的保留时间，未分离到化合物。本课题组对50kg孢子油进行分离，未得到三萜类化合物。余素以ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one为对照品，对来自上海、沈阳、吉林蛟河、山东济南、山东冠县、江苏东台、福建福州、福建龙岩等16个不同厂家的灵芝孢子油产品中的ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one含量进行测定，其含量在十万分之一到万分之二之间[4]。张丽测定7批灵芝孢子油麦角甾醇的含量在千分之一到十万分之四[5]。陈路林测定10批灵芝孢子油麦角甾醇的含量在千分之一点九到万分之四[6]。周晓宏测定三油酸甘油酯在灵芝孢子油中的质量分数高达18%[7]。曾荣华测定10批孢子油中三油酸甘油酯在灵芝孢子油中的质量分数为15%～18%[8]。到底灵芝孢子油质量标准应该以什么化合物作为标识成分，是麦角甾醇，ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one，还是甘油三酯？目前还没有结论。从灵芝孢子粉可分离得到三萜，但灵芝孢子油中并未检测到三萜类化合物，所以灵芝孢子油产品标识含有20%～30%的三萜是不符合实际的。关于灵芝孢子油中具体什么物质产生活性，有报道称孢子油中的不饱和脂肪酸抑瘤率达91%。以上都是灵芝孢子油标准制定中应该考虑的问题。根据目前的情况，亟需制定灵芝孢子油的质量控制标准。

关于灵芝子实体菌种及栽培标准的制定、灵芝孢子粉和孢子油的质量控制等，都是行业亟待解决的问题。组建灵芝行业协会，建立不同分会，团结起来做大做强在药用真菌大健康产业。国家和企业都应该加大资金的投入，以市场为引领，以行业协会为龙头，以企业为主体，制定全行业灵芝标准。可以产学研相结合，分头制定标准，如菌种标准、栽培标准、子实体标准、孢子粉标准、提取物标准、孢子油标准等。

参考文献

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[1]中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,.

[2]UnitedStatesPharmacopeial/nationalFomulary[M].UnitedStatesPharmacopeialConvention.Inc.,Rockville,MD,.

[3]李保明,古海峰,李晔,等.HPLC测定不同产地灵芝中9种三萜酸[J].中国中药杂志,,37(23):-.

[4]余素.灵芝孢子油的化学成分和抗肿瘤活性的研究[D].福建中医药大学,.

[5]张丽,王瑜杰,丁安伟,等.HPLC法测定灵芝孢子油中麦角甾醇的含量[J].江苏中医药,9,41(6).

[6]陈路林,李吉来,宁德山,等.灵芝孢子油中麦角甾醇含量测定方法研究[J].中药材,8,31(12):-.

[7]周晓,陈路林,高幼衡,等.HPLC.ELSD法测定灵芝孢子油中三油酸甘油酯的含量[J].广东药学院学报,,28(1)：54-56.

[8]曾荣华,李菁.HPLC法测定灵芝孢子油中甘油三油酸酯含量[J].ChinaLicensedPharrnacistAug,,9(8):17-19.

原文发表于：食药用菌,，24(6):-

▼往期精彩回顾▼灵芝产品质量管控体系的构建（上）“瑞草”灵芝之现代研究中药灵芝使用起源研究

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