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IdentificationandcharacterizationofcircularRNAsinGanodermalucidum

灵芝中环状RNA的鉴定和表征

期刊：Sci.Rep.（IF=4.）

发表单位：中国医学科学院药植研究所

导读

该项研究是一篇纯测序的描述性分析，首次鉴定并表征了灵芝中circRNA的表达谱。分析结果丰富了灵芝基因组资源，暗示了circRNA在参与灵芝中基因表达调控的潜在功能。

摘要

环状RNA（circRNA）在动物、植物和真菌中起重要作用。但是，灵芝中尚未见到circRNA的报道。本研究使用RNA-Seq数据对灵芝中circRNA进行了全基因组鉴定，并分析了它们的特征。从polyA(-)和polyA(-)/RNaseR处理的文库分别产生的链特异性RNA-seq数据中总共鉴定出50和个circRNA。在灵芝的三个发育阶段中总共表达了00个circRNA。个（16.3％）外显子circRNA及其亲本基因的表达谱显示出显著正相关，而6个（30.9％）外显子circRNA及其亲本基因则表现出显著的负相关，其中53个亲本基因可能参与转录调控、多糖生物合成等。结果表明，circRNA在灵芝中具有潜在的重要调控作用。

前言

随着高通量DNA测序技术和生物信息数据分析方法的发展，circRNA成为近来分子生物学研究的热点。然而，迄今尚未在担子菌中描述circRNA。灵芝是一种经济上重要的药用真菌，其基因组已获得了测序表征，因此已成为研究担子菌生物学的模型物种，这些数据为研究灵芝的生物学提供了基础。然而，灵芝中的circRNA尚未有表征。

本篇研究使用链特异性RNA-seq数据对灵芝中circRNA进行了转录组范围的鉴定，结果提供了灵芝中circRNA的概述，并提供了充分的证据表明circRNA可能参与了广泛生物学过程中基因的表达调控。

材料方法

从灵芝的三个发育阶段（菌丝体、原基和子实体）中提取总RNA，构建了polyA(-)和polyA(-)/RNaseR文库用于circRNA测序。

使用TopHat将cleanreads映射到灵芝参考基因组，使用CIRCexplorer基于反向剪接reads的存在识别circRNA。PCR和Sanger测序用于验证circRNA的真实性。

并对已鉴定的circRNA的各项特征作了详细描述，包括类型、基因组位置、剪接来源、差异表达、与亲本基因的相关性等，如下流程图所示（更详细材料和方法可以在在线补充材料中找到）。

结果

1从两种类型的circRNA鉴定文库生成的数据比较

由于灵芝的circRNA先前并未有过任何注释，作者首先鉴定了可能的circRNA，首先比较了不同RNA文库的识别效率。在菌丝体，原基和子实体中，polyA(-)/RNaseR文库鉴定了、和个circRNA，polyA(-)文库鉴定了17、13和个circRNA，表明polyA(-)/RNaseR文库能够富集更多的circRNA，且大多数circRNA在菌丝体中被鉴定。（polyA(-)/RNaseR文库的效率更高，这是毋庸置疑的。作者还在文中提到，下文分析重点放在从polyA(-)/RNaseR文库中鉴定到的circRNA上）我们也推荐老师们在送样测序时，选择制备polyA(-)/RNaseR文库，可富集更多的circRNA。

图1，使用polyA(?)/两种不同的文库构建方法鉴定circRNA的比较，分别显示在菌丝体（A），原基（B）和子实体（C）中鉴定的circRNA类型数量。

在三个发育阶段中鉴定出的circRNA的比较

作者还在三个发育阶段之间确定circRNA。三个阶段的两个重复实验中共有个circRNA，其中包括个外显子和79个内含子circRNA。种外显子circRNA中分别有种、47种和55种（4.％，11.5％和13.4％）分别在菌丝体、原基和子实体中发现。79种内含子circRNA分别有0种、种和9种（5.3％，7.8％和11.4％）分别在菌丝体、原基和子实体中发现。所有三个阶段共享64个外显子（15.6％）和7个内含子（8.9％）circRNA。

图，三阶段circRNA的比较，分别为外显子（A）和内含子（B）circRNA的数量。

3灵芝中circRNA的表征

在识鉴定了circRNA后，作者对它们的结构、类型、基因组分布等作了表征，主要包括以下几点。

分析外显子circRNA的位置，大多数circRNA（98.8％）被定位到基因中间的外显子上，从第一个和最后一个外显子中只能获得小部分circRNA，表明circRNA的生物发生与剪接过程有关。

为了确定circRNA生物发生是否表现出对外显子数量的偏好，比较了circRNA的外显子定位。单个反向剪接外显子体是circRNA的主要类型，大多数circRNA（80％）在三个阶段中都来自一个或两个反向剪接外显子。

为了确定circRNA的形成是否表现出对外显子长度的偏好，分析了外显子长度对circRNA形成的影响。结果显示，通常外显子长度随circRNA来源的外显子数目的增加而增加。

分析circRNA及其亲本基因之间的定位关系。总共个circRNA定位到个亲本基因，大多数亲本基因仅产生一种circRNA。

分析circRNA侧翼内含子的长度，因为它们会影响circRNA的形成。结果表明，circRNA的侧翼内含子显著长于对照内含子，符合先前研究的一般结论。

研究表明反向重复序列可导致RNA环化，作者因此鉴定了侧翼和对照内含子中的重复元件。反向重复元件的存在与circRNA的发生有关，因此应该确定这些反向重复是否参与了相关circRNA的生物发生。

此外，RT-PCR扩增和Sanger测序验证随机选择0具有高表达水平的circRN

图5，对选定circRNA的PCR和Sanger测序验证。

4三个发育阶段的circRNA亲本基因的功能富集分析

鉴于circRNA可能通过调节其亲本基因的表达而发挥功能，作者通过GO和KEGG分析不同发育阶段中circRNA亲本基因的功能。个亲本基因中，个被映射到个GO项，其中个GO术语显示了10个以上的亲本基因。19个亲本基因定位到08个KEGG途径，共发现11条KEGG通路包含超过10个定位到它们的基因。为了确定circRNA是否可以以发育特异性方式发挥作用，作者还在三个发育阶段的每个阶段进行了功能富集分析。菌丝体，原基和子实体分别富集了40、13和4个GO项以及8、17和6条KEGG途径。

GO和KEGG富集分析统计表的部分内容展示。

5circRNA在转录调控中的潜在作用

转录因子（TFs）在广泛的生物学过程中起作用，作者还确定了circRNA是否与TF因子相关。将circRNA的个亲本基因的蛋白质序列与FFTD中具有默认参数的蛋白质序列进行了比较，根据FFTD最佳匹配的注释，共有个亲本基因（8.0％）被注释为TF，68个circRNA及其56个亲本基因的表达谱呈正相关，38个circRNA及其亲本基因的表达谱呈负相关。

6外显子circRNA在三个发育阶段的差异表达

为了指示circRNA的阶段特异性作用，作者进行了阶段间差异表达circRNA分析。在三个发育阶段中，共计种外显子circRNA和3种内含子circRNA存在显著差异。个外显子circRNA中总共有、18和8个（85.3％，10.％和4.5％）分别在菌丝体、原基和子实体中表达最高，共有53个亲本基因可能参与转录调控、多糖生物合成等。

7circRNA及其亲本基因表达谱的相关性

通过确定circRNA及其亲本基因表达谱之间的相关性，个（16.3％）外显子circRNA及其亲本基因的表达谱呈显著正相关，6个（30.9％）显著负相关。

为了确定在非编码RNA及其亲本基因之间是否存在任何表达相关性，分析了0个circRNA及其亲本基因的表达谱。第一组包括五个属于CAZy家族的亲本基因，三个表达谱与其circRNA的表达谱正相关，两个负相关。第二组包括九对circRNA基因对，对应于属于CYP家族的六个亲本基因，四对显示正相关，五对显示负相关。第三组包括与木质素降解有关的一对正相关的circRNA基因对。第四组包括与MVA途径相关的一个亲本基因，该基因包含两个备选的circRNA，它们均与其亲本基因呈正相关。第五组包括两个正相关的circRNA基因对，亲本基因参与了多糖的生物合成。最后一组包括一个正相关的circRNA基因对，其参与了三萜酸途径。

circRNA及其亲本基因之间的高度相关性和多样的相关性模式表明，circRNA以复杂的方式参与其亲本基因的表达调控。

8灵芝中外显子circRNA的可变环化

考虑到一个亲本基因可以产生一种或多种circRNA，作者最后还确定了由9个不同的亲本基因位点产生的6个选择性反向拼接环化事件。

讨论

本研究首次在灵芝中报道鉴定和表征了circRNA，其表达模式具有组织、时间和/或空间特异性。多个circRNA源自位于同一基因座的外显子，即替代环化，表明灵芝circRNA的生物发生相当复杂。通过识别circRNA表达与其亲本基因的相关性，显示在基因表达调控方面，circRNA与其亲本基因之间存在更多的相互作用。所有这些数据指出，circRNA参与了灵芝中的基因表达调控。关于circRNA的生物发生机理和功能作用的知识，未来需进一步探究。

本篇文章中所提到的circRNA鉴定与表征，差异表达分析，功能富集分析及一系列图表的可视化等，我们均可以提供。

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